Journal of Crop Breeding

fa طبقه‎ بندی فیلوژنتیکی برخی ارقام نخل خرمای استان سیستان و بلوچستان بر اساس ژن کلروپلاستی matK Phylogenetic Classification of Some Date Palm Cultivars in Sistan and Baluchestan Province Based on the matK Chloroplasty Gene اصلاح نباتات مولكولي اصلاح نباتات مولكولي پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: نخل خرما با نام علمی (LPhoenix dactylifera ) گیاهی تک &lrm;لپه از خانواده Palmaceae است که کشت آن در دنیا و همچنین در ایران از یک سابقه طولانی برخوردار بوده است و در نواحی گرمسیری و نیمه‌گرمسیری و بسیاری از کشورها از جمله ایران پرورش می‌یابد. امروزه با پیشرفت علم، روش‌های شناسایی مولکولی در مطالعات سیستماتیک جایگاه ویژه‌ای پیدا کرده &lrm;اند. یکی از این روش &lrm;ها بررسی و مقایسه ساختار ژن&lrm; ها و قطعات DNA‌ دارای توالی‌های محافظت شده‌ای‌ است که طی فرایند‌های تکاملی در گونه‌ها و ارقام مختلف ساختار منحصر به&lrm; فرد خود را حفظ نموده&lrm; اند که به اصطلاح DNA بارکدینگ نامیده می&lrm; شوند. DNA بارکدینگ یک ابزار ارزشمند برای ارزیابی روابط فیلوژنتیک فراهم آورده است. در این روش، بخش کوچکی از ژنوم گیاه توالی‌‌یابی شده و برای مطالعه تنوع جمعیت‌‌ها و تعیین روابط خویشاوندی بین گونه‌‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌‌گیرد. بر همین اساس، در گیاهان نواحی مختلف از DNA هسته &lrm;ای (ITS، ITS2) و کلروپلاستی (rbcL، matK، trnH-psbA، atpF-atpH، nhdJ، psbK-psbI) به &lrm;عنوان بارکد پیشنهاد شده است. ژن کلروپلاستی matK که دارای سرعت تکاملی بالا در سطوح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی است، یکی از مناسب&lrm; ترین ژن&lrm; های کلروپلاستی برای حل روابط فیلوژنی و تکاملی در گستره &lrm;ای از سطوح تاکسونومیک از سطح گونه تا جنس، تیره و حتی فراتیره &lrm;ای در میان گیاهان به &lrm;ویژه نهان&lrm;دانگان است. این ژن می &lrm;تواند به&lrm; صورت تکی یا همراه با ژن&lrm; های دیگر برای شناسایی و معرفی گونه&lrm; های ناشناخته استفاده شود. بررسی تنوع ژنتیکی ذخایر ژرم &lrm;پلاسم موجود جهت اصلاح و تکثیر ارقام دارای صفات مطلوب امری ضروری است و اولین قدم در این فرایند شناسایی ارقام موجود و دسته &lrm;بندی آن&lrm;ها است. با توجه به اهمیت تولید خرما در کشور، جستجوی ارقام جدید، اصلاح ارقام موجود و بررسی تنوع موجود بین ارقام مختلف از راهکارهای مهم برای بهبود کمی و کیفی تولید خرما است. از آنجا که مطالعات زیادی در زمینه بررسی و تعیین میزان قرابت یا فاصله ژنتیکی ارقام مختلف خرما با استفاده از نشانگرهای ژنتیکی مناسب، صورت نگرفته &lrm;اند، لذا هدف از این پژوهش تعیین فاصله ژنتیکی، تعیین شباهت و دسته بندی ارقام نخل خرمای مورد مطالعه با استفاده از نشانگر matK بود تا با ترسیم درخت فیلوژنتیکی و مقایسه آنها با یکدیگر، مناسب بودن این نشانگر برای بررسی تنوع ژنتیکی و گروه &lrm;بندی ارقام مذکور مورد بررسی قرار گیرد. مواد و روش‌ها: در این تحقیق، به&lrm; منظور بررسی تنوع ژنتیکی موجود بین 15 رقم محلی خرما از شهرستان سراوان و بخش‌های جالق، ناهوک و سینوکان استان سیستان و بلوچستان، از ژن کلروپلاستی matK استفاده شد. استخراج DNA از برگ &lrm;های جوان ارقام مختلف با استفاده از روش دلاپورتا (1993) انجام شد و در ادامه کیفیت و کمیت DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز یک و نیم درصد و دستگاه اسپکتوفتومتر تعیین گردید. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن matK، واکنش زنجیره &lrm;ای پلیمراز انجام شد که قطعه حدود bp 900 تکثیر گردید. سپس محصولات PCR جهت توالی &lrm;یابی ارسال شدند. کیفیت نتایج حاصل از تعیین توالی بررسی شد و سپس با استفاده از نرم‌افزار BioEdit همتراز و نواحی دارای کیفیت توالی‌یابی پایین از دو انتهای '3 و '5 حذف شدند. توالی &lrm;ها پس از ثبت، جهت هم ترازی با سایر توالی‌های موجود در پایگاه داده NCBI بلاست شدند و میزان تشابه با سایر توالی‌های ثبت شده مورد بررسی قرار گرفت. بعد از هم ردیف کردن توالی‌ها، برخی پارامترهای ژنتیکی مانند تعداد جهش‌ها، تنوع نوکلئوتیدی، تعداد جایگاه‌هایی که در آنها جهش اتفاق افتاده بود و همچنین تنوع آنها مورد بررسی قرار گرفتد. در ادامه، جهت تعیین روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی بین ارقام مورد مطالعه از نرم‌افزارهای MEGA7 و همچنین برای ترسیم درخت فیلوژنی از روش خوشه &lrm;بندی UPGMA استفاده شد. یافته‌ها: مقایسه توالی &lrm;ها همولوژی بالایی را بین این توالی &lrm;ها با توالی‌های گونه Phoenix dactylifera موجود در بانک ژن نشان داد. نتایج توالی&lrm; یابی ارقام مورد بررسی در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. برای این نشانگر در مجموع 1019 موقعیت شناسایی شد که 672 جایگاه دارای حذف و اضافه، و 347 جایگاه بدون حذف و اضافه بودند. در این جمعیت، 15 هاپلوتایپ و همچنین چهار ناحیه حفاظت شده DNA برای نشانگر matK شناسایی شدند. مقدار عددی نسبت جایگزینی (dN/dS) برابر 0/169 بود و فاصله ژنتیکی نیز در دامنه 0/019 تا 1/238 مشاهده شد. بیشترین فاصله ژنتیکی (1/238) بین نمونه &lrm;های هلیله 20 از سراوان و پیمازو 16 از جالق مشاهده شد. پس از ترسیم درخت‌ فیلوژنتیکی، ارقام مورد مطالعه به سه شاخه تقسیم شدند که در شاخه اول رقم هلیله 20 که از شهرستان سراوان جمع &lrm;آوری شده بود، قرار گرفت. در شاخه دوم، رقم پیمازو 16 از جالق قرار گرفت. شاخه سوم خود به دو زیرشاخه تقسیم شد که در زیر شاخه فرعی اول در مجموع شش رقم و در زیر شاخه فرعی دوم در مجموع هفت رقم قرار گرفتند. بر اساس این تقسیم &lrm;بندی، رقم هلیله 20 از سراوان بیشترین فاصله را با سایر ارقام دارد. نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج حاصله می&lrm; توان نتیجه گرفت که استفاده از نشانگر matK برای مطالعه و شناخت تنوع و روابط درون&lrm; گونه‌ای خرما مفید و مناسب است. بنابر این، در مطالعات آتی بررسی تنوع ژنتیکی خرما، می &lrm;توان استفاده از این بارکد را در کنار سایر نشانگرهای مولکولی مناسب پیشنهاد نمود.  </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: The date palm (Phoenix dactylifera L.) is a monocotyledonous plant from the Palmaceae, which is cultivated in many countries from tropical and subtropical regions, including Iran. Today, owing to the progress of technology, molecular identification methods have special importance in systematic studies. One of these methods is DNA barcoding, which is species identification based on the sequences of conserved DNA regions that provide a valuable tool for assessing phylogenetic relationships. In this method, the comparison of the sequences of special conserved DNA fragments is used to study the diversity of populations and determine the relationships between different species. Accordingly, different regions of nuclear DNA (ITS, ITS2) and chloroplast (rbcL, matK, trnH-psbA, atpF-atpH, nhdJ, and psbK-psbI) have been suggested as important barcodes in plants. The matK chloroplast gene, which has a high evolutionary speed at the nucleotide and amino acid levels, is one of the most suitable chloroplast genes for the analysis of phylogeny and evolutionary relationships in a range of taxonomic levels from species to genus, phylum and even super phylum, in Angiosperms in particular. This gene can be used individually or together with other genes to identify and introduce unknown species. Examining the genetic diversity of the available germplasm reserves is essential for the improvement and propagation of cultivars with desirable traits, and the first step in this process is to identify the existing cultivars and classify them. Due to the importance of producing dates in Iran, browsing for new cultivars, breeding existing cultivars, and studying the existing diversity between different cultivars are among important strategies to improve the quantity and quality of date palm production. However, there are not enough studies on the investigation of the relationship or genetic distance of different date palm cultivars using suitable genetic markers. Therefore, the main objective of this research was to determine the capability of the matK marker for the analysis of genetic diversity and phylogenetic relationships of the studied date palm cultivars. Methods: In this research, the chloroplast gene matK was used to investigate the genetic diversity among 15 local date varieties from Saravan and Jalgh, Nahok, and Sinokan regions of Sistan and Baluchistan Province. DNA was extracted from young leaves of different cultivars using the Dellaporta (1993) method, and then the quality and quantity of DNA was determined using 1.5% agarose gel electrophoresis and a spectrophotometer. PCR was performed using specific primers of the matk gene, and a fragment of about 900 bp was amplified and sent for sequencing. The quality of the sequencing results was examined and then aligned using BioEdit software, and the regions with low sequencing quality were removed from the 3' and 5' ends. Next, the sequences were blasted for alignment with other sequences in the NCBI database to examine the degree of similarity with other registered sequences. After sequence alignment, key genetic parameters, including the total number of mutations, nucleotide diversity, the number of mutation sites, and the extent of their variation, were comprehensively analyzed. Then, MEGA7 software was used to determine the relationships and genetic distance between the studied cultivars, and the UPGMA method was also used to draw a phylogeny tree. Results: The comparison of the sequences showed a high homology between these sequences and the sequences of P. dactylifera species available in the gene bank. Sequencing results of the investigated cultivars were registered in the NCBI database. The results of the current research showed that a total of 1019 positions were identified for the matk marker used in this study, 672 positions of which included deletions and additions, and 347 positions were without deletions or additions. Fifteen haplotypes and four conserved DNA regions were identified in this population. The numerical value dN/dS was 0.169, and the genetic distance ranged from 0.019 to 1.238. The highest genetic distance (1.238) was observed between the samples of Halile20 from Saravan and Pimazo16 from Jalgh. After drawing the phylogeny tree, the studied cultivars were divided into three branches, in which Halileh 20 from Saravan was located in the first branch. The Pimazo 16 variety from Jalgh was placed in the second branch. The third branch was divided into two sub-branches, in which there were a total of six numbers in the first sub-branch and a total of seven numbers in the second sub-branch. According to this classification, Halileh 20 of Saravan is the most distant from the other varieties. Conclusion: Based on the obtained results, it can be concluded that the use of the matk marker has been useful and suitable for studying and understanding the diversity and intraspecies relationships of date palms. Therefore, it is possible to suggest the use of this barcode in addition to other suitable molecular in future date palm studies to investigate genetic diversity.  </div> بارکدینگ DNA, روابط فیلوژنتیک, فاصله ژنتیکی, نخل خرما, نشانگر matK Data palm, DNA barcoding, Genetic distance, matK marker, Phylogenetic relationships 173 184 http://jcb.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-168-20&slc_lang=fa&sid=1 Fatemeh Raeisi فاطمه رئیسی raisi@yahoo.com 100319475328460027508 100319475328460027508 No Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran گروه اصلاح ‌نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران Leila Fahmideh لیلا فهمیده l.fahmideh@gau.ac.ir 100319475328460027509 100319475328460027509 Yes Department of Plant Breeding and Biotechnology, Plant Production Faculty, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran گروه اصلاح‌ نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران Barat Ali Fakheri براتعلی ‌ فاخری fakheri@yahoo.com 100319475328460027510 100319475328460027510 No Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran گروه اصلاح ‌نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران Mojtaba Keykhasaber مجتبی کیخاصابر mkeikhasaber@yahoo.com 100319475328460027511 100319475328460027511 No Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران