fa کلونینگ و ارزیابی بیوانفورماتیکی ژن مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (MDHAR) در گیاه آلوروپوس لیتورالیس و بررسی بیش‌بیان آن در گیاه توتون (Nicotina tobacum) اصلاح نباتات General پژوهشي Research <p><strong>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; شوری</strong> <strong>خاک</strong> <strong>یکی</strong> <strong>از مهم&shy;ترین</strong> <strong>عوامل</strong> <strong>غیرزنده&shy;، با</strong> <strong>برهم</strong> <strong>زدن</strong> <strong>شرایط</strong> <strong>مطلوب است که</strong> <strong>سبب</strong> <strong>بروز</strong> <strong>اختلالات</strong> <strong>متابولیسمی</strong> <strong>در سلول&rlm;های</strong> <strong>گیاهی، از جمله</strong> <strong>افزایش</strong> <strong>تولید</strong> <strong>انواع</strong> <strong>گونه&shy;های</strong> <strong>اکسیژن</strong> <strong>فعال (</strong><strong><span dir="LTR">ROS</span></strong><strong>)</strong> <strong>می&shy;گردد</strong><strong><span dir="LTR"> .</span></strong><strong>مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (</strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong>) یکی از آنزیم&rlm;های کلیدی در مسیر گلوتاتیون-آسکوربات است که نقش احیاکنندگی رادیکال&rlm;های مونودهیدروآسکوربات را بر عهده دارد. در تحقیق حاضر آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز، از گیاه هالوفیت آلوروپوس لیتورالیس (</strong><em><strong><span dir="LTR">Aeluropus littoralis</span></strong><strong>) شناسایی، جداسازی و هم‌سانه&shy;سازی گردید و به گیاه توتون انتقال داده شد. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه </strong></em><strong><span dir="LTR">NCBI</span></strong><strong>، پرایمرهای مناسب طراحی و با روش </strong><strong><span dir="LTR">RT-PCR</span></strong><strong> توالی ژنی مذکور تکثیر و به منظور توالی یابی در وکتور </strong><strong><span dir="LTR">pTZ57R/T</span></strong><strong> درون باکتری ای.کلای (</strong><strong><span dir="LTR">DH5&alpha;</span></strong><strong>) هم‌سانه&shy;سازی شد. سپس به منظور انتقال به گیاه توتون، با آنزیم </strong><strong><span dir="LTR">pfu</span></strong><strong> دی. ان. آ. پلیمراز تکثیر گردید. پس از الحاق پروموتر و ترمیناتور </strong><strong><span dir="LTR">35S</span></strong><strong> به ناقل بیانی </strong><strong><span dir="LTR">pGreen0029</span></strong><strong>، توالی ژنی </strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong> نیز به این ناقل وارد شد و سازه&shy;ی نوترکیب به سلول&shy;های اگروباکتریوم نژاد </strong><strong><span dir="LTR">LBA4404</span></strong><strong> ترانسفورم شد و برای تراریخت&shy;سازی توتون به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. از گیاهان باززایی شده در محیط انتخابی</strong> <strong>حاوی آنتی&shy;بیوتیک کانامایسین استخراج </strong><strong><span dir="LTR">DNA</span></strong><strong> و سپس </strong><strong><span dir="LTR">RNA</span></strong><strong> صورت گرفت و آزمون&shy;های </strong><strong><span dir="LTR">PCR</span></strong><strong> و </strong><strong><span dir="LTR">RT-PCR</span></strong><strong> انجام شد. آزمون </strong><strong><span dir="LTR">PCR</span></strong><strong> با </strong><strong><span dir="LTR">DNA</span></strong><strong> گیاهان انتخابی نشان داد توالی ژنی </strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong> به سلول&shy;های گیاهان تراریخت وارد شده و بیان مستمر این ژن نیز توسط آزمون </strong><strong><span dir="LTR">RT-PCR</span></strong><strong> تأیید شد. بررسی&shy;های بیوانفورماتیکی روی ژن نشان داد که ژن </strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong> شامل 1436 جفت باز و فاقد نواحی اینترونی است. مقایسه&shy;ی توالی به دست آمده با توالی&shy;های سایر </strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong>&shy;های گیاهی ثبت شده در بانک ژن، بیانگر شباهت بالای این ژن با سایر </strong><strong><span dir="LTR">MDHR</span></strong><strong>&shy;های جدا شده از گیاهان خانواده&shy;ی گندمیان بوده که با </strong><strong><span dir="LTR">MDHAR</span></strong><strong>&shy; سورگم (</strong><strong><span dir="LTR">Sorghum bicolor</span></strong><strong>)، بیشترین شباهت را داشت. آنالیز ساختار پروتئینی، بین سلولی بودن و نواحی موتیف </strong><strong><span dir="LTR">pyr-redoxin</span></strong><strong> و </strong><strong><span dir="LTR">SDR</span></strong><strong> را اثبات کرده و نیز بررسی ساختار ثانویه، نشان&shy;دهنده&shy;ی 3/78 درصد ساختار مارپیچ آلفا، 1/41 درصد ساختار چین خورده ی بتا و 6/13 درصد ساختار دور بتا یا دور معکوس بود.</strong></p> <p>Salinity as one of the most important stresses disturbs favorable growth conditions of the plants leading to several metabolic disorders such as reactive oxygen species (ROS). Monodehydroascorbate reductase (MDHAR) with FAD (Flavin adenine dinucleotide) co-factor is one of the key enzymes in Glutathione-ascorbate pathway which reduces monodehydroascorbate (MDHA) radicals. In this study MDHAR gene was isolated from <em>Aeluropus littolaris</em>, a halophyte plant with, characterized and was transferred to tobacco plants after cloning. Gene specific primers were designed using similar sequences in NCBI and the desired sequence was amplified via RT-PCR, cloned in pTZ57R/T vector and sequenced.&nbsp; Primary bioinformatics assessments revealed that MDHAR gene consisted of 1436 bp lacking intron sequences. For tobacco transformation, cDNA fragment was amplified with Pfu DNA polymerase, inserted into pGreen0029 containing 35s promoter and terminator sequences. The recombinant vector was then introduced to LBA4404 agrobacterium cells, which were used for tobacco transformation via leaf disc method PCR analysis of the putative transgenic plants, indicated successful gene insertion into plant cells and gene transcription was confirmed by RT-PCR. Comparing which MDHAR sequences form other plants in NCBI, A. <em>littoralis</em> gene exhibited a high similarity with genes isolated from gramineae family. The highest similarity (89%) was observed for MDHARs from sorghum (<em>Sorghum bicolor</em>). Protein also analysis has proven that this gene is outside cell, pyr-redoxin and NAD-binding motif area. Secondary structure showed 78.3% alpha helix, 41.1% beta sheet and structure 13.6% &nbsp;B-turn structure or reverse turn.&nbsp;&nbsp;</p> گونه‌های اکسیژن فعال, مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (MDHAR), آلوروپوس لیتورالیس, ناقل pGreen0029, توتون, تراریخت littolaris, Mono Dehydro Ascorbate Reductase (MDHAR), Pgreen Vector, Reactive Oxygen Spices (ROS), Tobacco, Transgenic 230 219 http://jcb.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-173&slc_lang=fa&sid=1 آزاده محسنی 10031947532846004085 10031947532846004085 Yes قربانعلی نعمت زاده 10031947532846004086 10031947532846004086 No علی دهستانی کلاگر 10031947532846004087 10031947532846004087 No بهزاد شاهین کلیبر 10031947532846004088 10031947532846004088 No الهام سلیمانی 10031947532846004089 10031947532846004089 No