Journal of Crop Breeding

fa بررسی بیوانفورماتیکی فلاونوئید ´3 هیدروکسیلاز (F3'H) در گیاه خارمریم (.Silybum marianum L) Bioinformatics Analysis of Flavanone-3՛-hydroxylase (F3՜H) in Silybum marianum بيوتكنولوژي گياهي بيوتكنولوژي گياهي پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: گیاهان دارویی به &lrm;دلیل تولید متابولیت‌های ثانویه با اثرات دارویی، اهمیت زیادی در تغذیه انسان و درمان بسیاری از بیماری &lrm;ها دارند. گیاه دارویی خارمریم (L.marianum  Silybum) متعلق به خانواده Asteraceae، دارای ماده موثره مهم سیلی‌مارین است که در درمان بیماری&lrm;های کبدی مورد استفاده قرار می‌گیرد. شناخت دقیق مسیرهای مولکولی و ژن&lrm; های دخیل در تولید این ترکیب برای بهبود و افزایش تولید آن اهمیت ویژه&lrm; ای دارد. بر این اساس تحلیل عملکرد ژن&lrm; ها و پروتئین&lrm; های مسیر تولید سیلی‌مارین حائز اهمیت است. فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز (F3'H) یکی از آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز سیلی‌مارین است. یکی از روش‌های تحلیل عملکرد ژن‌ها و پروتئین‌ها مطالعه بیوانفورماتیکی آنها است. بنابر این، در این پژوهش به بررسی بیوانفورماتیکی توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز (F3'H) پرداخته شد.</div> <pre dir="RTL" style="text-align: justify;"> مواد و روش‌ها: برای بررسی بیوانفورماتیکی توالی نوکلئوتیدی ژن فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز (F3'H) در گیاه خارمریم (S. mariyanum)، از مقاله‌ای که توالی نوکلئوتیدی این ژن در آن گزارش شد، استفاده شد. به این منظور توالی mRNA آن از پایگاه داده NCBI به شماره دسترسی KP861882.1 دریافت شد. جهت آنالیز توالی نوکلئوتیدی از پایگاه محاسباتی ppuigbo استفاده شد. به&lrm; منظور آنالیز پروموتر ژن مورد نظر از سایت‌ Plantcare استفاده شد. از پایگاه داده NCBI توالی پروتئینی ژن مورد نظر به شماره دسترسی ALA39990.1 به دست آمد و از پایگاه داده uniprot اطلاعات مربوط به پروتئین فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز گیاه خارمریم به شماره دسترسی A0A0K2F2U بررسی شد. همچنین، دومین پروتئین از پایگاه داده NCBI و interpro شناسایی شد. با استفاده از پایگاه داده ProtParam خواص فیزیکوشیمیایی آن بررسی شد. موتیف‌ها از پایگاه داده meme و عملکرد موتیف‌های مورد بررسی از پایگاه داده elm ارزیابی شدند. مدل&lrm; سازی ساختار دوم و سوم پروتئین F3'H با پایگاه داده  phyre2 و پیش &lrm;بینی میزان دسترسی بنیان‌های پروتئین F3'H به حلال با سرور I-TASSE انجام شد. در پایان، کیفیت ساختار استریوشیمی پروتئینF3'H  مدل&lrm;سازی شده با سرور phyre2، توسط نقشه راماچاندران با نرم&rlm;افزار PROCHECK ارزیابی شد.</pre> <div style="text-align: justify;">یافته‌ها: طبق بررسی&lrm; های انجام&lrm; شده از مجموعه مراحل یادشده در بخش مواد و روش&lrm; ها، این ژن دارای 1557 نوکلئوتید، با 51/87 درصد سیتوزین-گوانین است. از نقطه &lrm;نظر mRNA، mRNA آن از 1317 جفت باز تشکیل شده است که پروئتینی را کد می&lrm; کند که طول اسیدآمینه آن 349 است. در توالی پروموتوری ژن F3'H، 24 عنصر تنظیمی پیش&lrm; بینی شد که TATA-box و CAAT-box بیشترین عنصر تنظیمی ناحیه پروموتوری این ژن بودند؛ همچنین، این ژن دارای چندین عنصر تنظیمی پاسخ به نور بود. خواص فیزیکوشیمیایی به دست آمده برای این پروتئین با 349 اسیدآمینه و وزن مولکولی 48/320 کیلودالتون نشان داد که شاخص آلیفاتیک 99/32 و نقطه ایزوالکتریک پیشبینی شده 7/87، شاخص GRAVY 0/059- بود .تعداد 49 اسیدآمینه (آسپاراتیک اسید و گلوتامیک اسید) دارای بار منفی و 50 اسیدآمینه دارای بار مثبت (آرژنین و لیزین) تعیین شد. همچنین، در بررسی ضریب خاموشی این پروتئین مشخص شد که ضریب خاموشی پروتئین یادشده در nm 280 در محیط آب برابر 80330 بود و شاخص ناپایداری آن 34/65 است. مطابق با ارزیابی های صورت گرفته، برای این پروتئین یک دومین از سوپر خانواده P450 و چهار موتیف قابل شناسایی هستند. در ساختار این پروتئین، 45% مارپیچ آلفا، 5% صفحه بتا، و 4% مارپیچ &rlm;های غشایی  وجود دارند و محل اتصال لیگاند مربوط نیز پیش&lrm; بینی شد. بررسی نمودار راماچاندران برای مدل‌ پیش‌بینی شده نشان داد که 87/5% اسیدهای آمینه در ناحیه مطلوب، 11/7% در ناحیه مجاز، 0/3% در ناحیه تقریبا مجاز و 0/5% در ناحیه غیر مجاز قرار داشتند. علاوه بر این، بیشترین تراکم نقاط مجاز با مارپیچ آلفای راستگردان و صفحات بتا مطابقت دارد. مجموع ناحیه مطلوب و مجاز 99/2% می‌شود؛ بنابر این، مدل ارائه شده برای پروتئین F3'H گیاه خارمریم در این مطالعه قابل قبول است. نتیجه&lrm; گیری: در مطالعه بیوانفورماتیکی ژن فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز، عناصر تنظیمی مربوط به پاسخ به نور، پاسخ به آبسیزیک اسید، پاسخ به دمای پایین، متابولیسمzein  و مسیر بیوسنتز فلاونوئید در پروموتور این ژن شناسایی شدند. همچنین، بررسی بیوانفورماتیکی پروتئین فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز نشان داد که این پروتئین در ردیف پروتئین&lrm; های غیر قطبی و نسبتا پایدار قرار دارد. به&lrm; علاوه، یک دومین از سوپر خانواده P450 و چهار موتیف در این پروتئین شناسایی شدند و مدل پیش &lrm;بینی شده پروتئین با 45% مارپیچ آلفا، 5% صفحه بتا، 4% مارپیچ‌های غشایی و محل اتصال لیگاند مربوط به "هم"، مدل نیز از وضعیت مطلوبی برخوردار بود. بنابر این، نتایج این مطالعه امکان درک بهتر مکانیزم‌های تنظیمی و عملکردی فلاونوئید '3 هیدروکسیلاز را با بررسی ساختار ژنی، عناصر تنظیمی پروموتر، خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئین F3'H، پیش &lrm;بینی ساختار این پروتئین و محل اتصال لیگاند به F3'H را فراهم می&lrm; آورند. با توجه به اهمیت سیلی‌مارین در درمان بیماری‌های کبدی، بهبود و افزایش تولید این ماده موثره مهم می‌تواند به ارتقای کیفیت محصولات دارویی و افزایش بهره&lrm;‌وری در کشاورزی دارویی منجر شود. بنابر این، یافته‌های این مطالعه کاربردهای عملی مهمی در بیوتکنولوژی و اصلاح گیاه خارمریم به &lrm;منظور افزایش سیلی‌مارین دارند.  </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: Medicinal plants play a crucial role in human nutrition and the treatment of numerous diseases due to their ability to produce secondary metabolites with therapeutic properties. Silybum marianum L., a medicinal plant belonging to the Asteraceae family, contains silymarin as its principal bioactive compound, which is widely used in the treatment of liver-related disorders. A comprehensive understanding of the molecular pathways and the genes involved in the biosynthesis of this compound is essential for its improvement and enhanced production. Accordingly, functional analysis of the genes and proteins participating in the silymarin biosynthetic pathway holds significant importance. Flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) is one of the key enzymes involved in this pathway. Among the various approaches available for gene and protein function analysis, bioinformatics methods offer a powerful and efficient means of investigation. Therefore, a bioinformatics analysis of the nucleotide and protein sequences of the flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) gene was conducted in the present study. Methods: A previously published article reporting the nucleotide sequence of this gene was utilized for the bioinformatics investigation of the nucleotide sequence of the flavonoid3-hydroxylase (F3'H) gene in the milk thistle plant (S. marianum). The mRNA sequence was retrieved from the NCBI database with the accession number KP861882.1. The nucleotide sequence analysis was performed using the ppuigbo computational database. Additionally, the Plantcare website was employed to analyze the promoter of the gene of interest. The protein sequence of the gene of interest was obtained from the NCBI database under the accession number ALA39990.1, and information regarding the flavonoid3-hydroxylase protein from the milk thistle plant was examined through the Uniprot database with the accession number A0A0K2F2U. Furthermore, the protein domain was identified using the NCBI and InterPro databases. The physicochemical properties of the protein were analyzed using the ProtParam database. Motifs were identified from the meme database, and the functionality of these motifs was assessed through the elm database. The modeling of the secondary and tertiary structures of the F3'H protein was conducted using the phyre2 database, and the accessibility of the F3'H protein bases to solvents was predicted with the I-TASSER server. Finally, the quality of the stereochemical structure of the modeled F3'H protein was evaluated with the PROCHECK software using the Ramachandran plot. Results: The investigations carried out in the Materials and Methods section indicate that this gene consists of 1557 nucleotides, with a C-G content of 51.87%. From the perspective of mRNA, it comprises1317 base pairs that encode a protein with an amino acid length of 349. In the promoter sequence of the F3'H gene, 19 regulatory elements were predicted, with the TATA-box and CAAT-box being the most prominent regulatory elements in the promoter region of this gene. Additionally, this gene contains several light-responsive regulatory elements. The physicochemical properties obtained for this protein, which has 349 amino acids and a molecular weight of 48.320 kDa, indicated an aliphatic index of 32.99 and a predicted isoelectric point of 7.87, with a GRAVY index of -0.059. It was determined that there are 49 negatively charged amino acids (aspartic acid and glutamic acid) and 50 positively charged amino acids (arginine and lysine). Furthermore, the extinction coefficient of this protein was found to be 80,330 at 280 nm in an aqueous environment, with an instability index of 34.65. Evaluations also revealed that this protein contains one domain from the P450 superfamily and four identifiable motifs. The structure of this protein consists of 45% alpha helices, 5% beta sheets, and 4% membrane helices, and the corresponding ligand-binding site was predicted. The analysis of the Ramachandran plot for the predicted model indicated that 87.5% of the amino acids fell within the favored region, 11.7% in the allowed region, 0.3% in the nearly allowed region, and 0.5% in the disallowed region. Moreover, the highest density of permissible points corresponds to right-handed alpha helices and beta sheets. The combined favored and allowed regions amounted to 99.2, thus rendering the model presented for the F3'H protein of milk thistle acceptable in this study. Conclusion: In the bioinformatics study of the flavonoid3-hydroxylase gene, regulatory elements related to light response, abscisic acid response, cold temperature response, zein metabolism, and flavonoid biosynthesis pathways were identified in the promoter of this gene. Additionally, the bioinformatics analysis of the flavonoid3-hydroxylase protein demonstrates that this protein is positioned among relatively stable proteins. Furthermore, a domain of the P450 superfamily was identified in this protein, and the predicted model of the protein, with 45% alpha helices, 5% beta sheets, 4% membrane helices, and a corresponding ligand-binding site, also exhibits a favorable conformation. Considering the importance of silymarin in the treatment of liver diseases, improving and enhancing the production of this vital bioactive compound can lead to the advancement of pharmaceutical product quality and increased efficiency in medicinal plant agriculture. Therefore, the findings of this study have significant practical applications in biotechnology and the genetic improvement of S. marianum aimed at increasing silymarin content.  </div> سیلیمارین, عناصر تنظیمی پروموتور, پروتئین, موتیف, نمودار راماچاندران Motif, Promoter regulatory elements, Protein, Ramachandran diagram, Silymarin 149 162 http://jcb.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1282-1&slc_lang=fa&sid=1 Hoda Alsadat Aghili هدی السادات عقیلی hoda_aghili@yahoo.com 100319475328460027102 100319475328460027102 No Horticulture Science, Plant Production, Gorgan University of Agricultural Science and Natural Resources, Gorgan, Iran گروه علوم باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران Azim Ghasemnezhad عظیم قاسم نژاد Ghasemnezhad@gau.ac.ir 100319475328460027103 100319475328460027103 Yes Horticulture Science, Plant Production, Gorgan University of Agricultural Science and Natural Resources, Gorgan, Iran گروه علوم باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران Hossein Moradi حسین مرادی moradiho@yahoo.com 100319475328460027104 100319475328460027104 No Horticulture Science, Crop Science, Sari University of Agricultural Science and Natural Resources, Sari, Iran گروه علوم باغبانی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران Valiollah Ghasemi Omran ولی اله قاسمی عمران ghasemiomran@yahoo.com 100319475328460027105 100319475328460027105 No Crop Science Genetic & Agricultureal Biotecnology Institute of Tabarestan, Sari University Agricultural Science and Natural Resources, Sari, Iran پژوهشکده ژنتیک و زیست‎ فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران