Journal of Crop Breeding

fa تجزیه فیلوژنی برخی ژن‎ های مسیر بیوسنتزی اسیدکلروژنیک در گیاه دارویی شیرتیغک وحشی (.Sonchus arvensis L) Phylogeny Analysis of Some Genes Involved in the Chlorogenic Acid Biosynthesis Pathway in the Medicinal Plant Sonchus arvensis L. بيوتكنولوژي گياهي بيوتكنولوژي گياهي پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: شیرتیغک وحشی (L.Sonchus arvensis ) گیاهی دارویی از خانواده کاسنیان است. خواص دارویی ارزشمند این گیاه به&lrm;دلیل وجود اسیدهای فنلی مهم و با ارزشی مانند اسید&lrm;کلروژنیک است. کاهش خطر ابتلا به بیماری&lrm;های مختلف مانند بیماری&lrm;های قلبی، دیابت و سرطان به&lrm;دنبال مصرف اسید&lrm;کلروژنیک در مطالعات بالینی و تحقیقی به اثبات رسیده است. بنابراین، تحقیقات بیشتری در زمینه پزشکی و داروسازی در این گیاه در آینده مد نظر محققین است. هم&lrm;چنین، اطلاعات کمی درباره ژنتیک متابولیسم ثانویه در گیاهان دارویی وجود دارد، به&lrm;طوری که ژن&lrm;های بسیاری از مسیرهای بیوسنتز متابولیت&lrm;های ثانویه شناسایی نشده اند و اطلاعات کمی درباره تنظیم و عملکرد انواع آن&lrm;ها وجود دارد. بنابراین، شناسایی مسیرهای بیوسنتزی و اطلاع از نحوه تنظیم ژن&lrm;های دخیل در این مسیرها و تجزیه فیلوژنی آن&lrm;ها اهمیت ویژه&lrm;ای دارد. از سویی، بررسی روابط فیلوژنتیکی ژن&lrm;ها در گونه&lrm;های مختلف گیاهی و تعیین روابط تکاملی بین آن&lrm;ها می&lrm;تواند در درک بهتر سیر تحول گونه&lrm;ها کمک کند. هم&lrm;چنین، اطلاع از توالی نوکلئوتیدی ژن&lrm;ها و فراوانی نوکلئوتیدهای مختلف جهت برآورد زمان واگرایی گونه&lrm;ها و احیا کردن روابط تکاملی میان گونه&lrm;های مختلف ضروری است. هدف از تحقیق حاضر توالی&lrm;یابی بخشی از ناحیه کد&lrm;کننده ی برخی ژن&lrm;های دخیل در مسیر بیوسنتزی اسیدکلروژنیک، مانند سینامات4-هیدروکسیلاز (C4H)، P-کوماریول-استر3'-هیدروکسیلاز (C3'H) و هیدروکسی سیناموئیل کوآ شیکمات/ کوینات هیدروکسی سیناموئیل ترانسفراز (HCT)، و بررسی روابط تکاملی و فیلوژنی آن&lrm;ها در گیاه شیرتیغک وحشی است. مواد و روش&lrm;ها: از آن&lrm;جایی که توالی ژن&lrm;های C4H، HCT و C3'H در گیاه S. arvensis شناسایی نشده بود، توالی&lrm;های آن&lrm;ها از طریق گیاهانی که به لحاظ تکاملی به S. arvensis نزدیک بودند، مانند سایر جنس&lrm;های خانواده کاسنی (کنگر فرنگی: var. scolymus Cynara cardunculus) و کاسنی (Cichorium. intybus) بازیابی شد. ابتدا توالی ‌این ژن&lrm;ها در گیاهانی که از نظر فیلوژنتیکی به S. arvensis نزدیک بودند از GenBank جمع‌آوری شد. همردیفی با استفاده از نرم‌افزار Clustal omega انجام گرفت و مناطق حفاظت‌&lrm;شده شناسایی شدند. سپس آغازگر&lrm;های اختصاصی براساس نواحی حفاظت&lrm;شده با استفاده از نرم&lrm;افزار&lrm;های Fast PCR 4.0 و Gen Runner 3.05 طراحی شدند. در مرحله بعد، DNA از نمونه&lrm;های برگی به&lrm;روش CTAB استخراج شد و با استفاده از آغازگر&lrm;های اختصاصی طراحی&lrm;شده و واکنش زنجیره&lrm;ای پلیمراز (PCR) قطعات ژن&lrm;های مورد مطالعه در شیر تیغک وحشی تکثیر شدند. الکتروفورز محصولات حاصل با استفاده از ژل آگارز یک و نیم درصد با ولتاژ 80 به&lrm;مدت یک الی دو ساعت انجام شد و پس از رنگ&lrm;آمیزی با اتیدیوم بروماید، عکس&lrm;برداری با استفاده از دستگاه ژل&lrm;داک (INFINITY، فرانسه) صورت&lrm; گرفت. با توجه به اختصاصی بودن محصولات حاصل از تکثیر، محصولات PCR مستقیما برای توالی&lrm;یابی بخشی از نواحی کد&lrm;کننده&lrm;ی&lrm; ژن&lrm;های C4H، C3'H و HCT به شرکت میکروسینس سوییس ارسال شدند. برای اطمینان، تمام محصولاتPCR  در هر دو جهت رو به جلو و معکوس توالی&lrm;یابی شدند و برای تأیید صحت قطعات توالی‌یابی شده، هم&lrm;ردیفی (BLAST) قطعات توالی‌یابی شده در برابر پایگاه‌های داده DNA،RNA  و پروتئین انجام شد. سپس روابط فیلوژنی و هم&lrm;چنین فراوانی جهش&lrm;های نوکلئوتیدی در این ژن&lrm;ها مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای بررسی روابط فیلوژنی (روش حداکثر درست&lrm;نمایی) و تجزیه و تحلیل توالی&lrm;های نوکلئوتیدی (شامل فراوانی و جایگزینی) از نرم&lrm;افزارMEGA5  و BLAST استفاده شد. برای بررسی همردیفی توالی&lrm;های نوکلئوتیدی و پروتئینی از نرم&lrm;افزار Clustal Omega استفاده شد. تجزیه و تحلیل آمینواسید&lrm;ها (درصد و وزن امینواسید&lrm;ها و پروتئین&lrm;های استنباطی) با نرم&lrm;افزار&lrm;های Bio Edit و MEGA5 و تست Neutrality با نرم&lrm;افزار MEGA5 انجام&lrm; گرفت. یافته&lrm;ها: برای اولین&lrm;بار در این تحقیق، بخشی از توالی ناحیه کد&lrm;کنندهی ژن&lrm;های C4H، C3'H و HCT در شیرتیغک وحشی شناسایی و در بانک ژن (GenBank) به ترتیب با شماره های دسترسی ON014597.1، ON014595.1 و ON014596.1 ثبت شدند. نتایج مربوط به تجزیه و تحلیل توالی&lrm;های نوکلئوتیدی نشان دادند که بیشترین فراوانی نوکلئوتیدی برای ژن&lrm;های  C4H، C3'H و HCT به&lrm;ترتیب مربوط به آدنین (28/1)، گوانین (28/4) و تیمین (28/1) و کمترین فراوانی نوکلئوتیدی به&lrm;ترتیب متعلق به باز&lrm;های تیمین (13/2)، تیمین (20/1) و سیتوزین (19/7) بودند. نتایج تست Neutrality انتخاب جهت&lrm;دار بر روی این ژن&lrm;ها را در طول تکامل نشان دادند. جهش جایگزینی انتقالی بیشتر از جهش جایگزینی تقاطعی بود و آنالیز فیلوژنتیکی براساس توالی&lrm;های ژنیC4H، HCT وC3'H  رابطه فیلوژنتیکی نزدیکی بین S. arvensis و کاهو (Lactuca. sativa) را نشان داد. نتایج حاصل از بلاست توالی&lrm;ها در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی، شباهت بالای توالی ژن&lrm;های مورد مطالعه در شیرتیغک وحشی به توالی&lrm;های ژن&lrm;های متناظر در گیاه L. sattiva را نشان دادند. نتیجه&lrm;گیری کلی: نتایج این پژوهش، روند انتخاب طبیعی در طی تکامل برای ژن&lrm;های C4H، C3'H و HCT در گیاه شیرتیغک وحشی را مثبت ارزیابی کردند که نشان دهنده اثرات رانش ژنتیکی و یا اثرات متعادل کننده تکامل جمعیت در طول تاریخ است. نتایج BLAST قطعات ژنی توالی‌یابی‌شده&lrm;ی مربوط به ژن&lrm;های C4H،HCT و C3'Hدر S. arvensis ‌ در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی بیشترین درصد شباهت (کمترین فاصله ژنتیکی) را با گیاهانی مانند L. sativa و C. intybusنشان دادند که تاییدی بر صحت نتایج توالی&lrm;یابی است. هم&lrm;چنین، آنالیز فیلوژنتیکی براساس توالی&lrm;یابی ژن&lrm;های C4H، C3'H و HCT رابطه فیلوژنتیکی نزدیکی را بین S. arvensis و L. sativa نشان داد.  </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: Sonchus arvensis L. is a medicinal plant from the Asteraceae family. The valuable medicinal properties of this plant are due to the presence of important and valuable phenolic acids, such as chlorogenic acid. Reducing the risk of various diseases, such as heart disease, diabetes, and cancer, following the consumption of chlorogenic acid has been proven in clinical and research studies. Therefore, more research in the field of medicine and pharmacy on this plant will be considered by researchers in the future. Moreover, there is little information about the genetics of secondary metabolism in medicinal plants. Thus, the genes of many secondary metabolite biosynthesis pathways have not been identified, and little information exists about their regulation and function. Therefore, identifying biosynthetic pathways, knowing how the genes involved in these pathways are regulated, and analyzing their phylogeny are particularly important. On the other hand, examining the phylogenetic relationships of genes in different plant species and determining the evolutionary relationships between them can help better understand the evolution of species. Furthermore, knowledge of the nucleotide sequence of genes and the frequency of different nucleotides is essential for estimating the divergence time of species and reconstructing the evolutionary relationships between different species. The present study aimed to sequence part of the coding region of some genes involved in the chlorogenic acid biosynthetic pathway, such as cinnamate 4-hydroxylase (C4H), P-coumarol-ester 3'-hydroxylase (C3'H), and hydroxycinnamoyl coashimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase (HCT), and to investigate their evolutionary and phylogenetic relationships in S. arvensis. Methods: Since the sequences of C4H, HCT, and C3'H genes were not identified in S. arvensis, their sequences were recovered from plants that are evolutionarily close to S. arvensis, such as Cynara cardunculus var. scolymus and Cichorium. intybus. First, the sequences of these genes in plants phylogenetically close to S. arvensis were collected from GenBank and aligned using Clustal Omega software, followed by identifying conserved regions. Then, specific primers were designed based on the conserved regions using Fast PCR 4.0 and Gen Runner 3.05 software. In the next step, DNA from leaf samples was extracted by the CTAB method, and the studied gene fragments in S. arvensis were amplified using the designed specific primers and polymerase chain reaction (PCR). Electrophoresis of the resulting products was performed using a 1.5% agarose gel at a voltage of 80 V for one to two hours. After staining with ethidium bromide, a photograph was taken using a Gel Doc device (INFINITY, France). Given the specificity of the amplified products, the PCR products were sent directly to Microsynth Company (Switzerland) for sequencing part of the coding regions of the C4H, C3'H, and HCT genes. To ensure reliability, all PCR products were sequenced in both forward and reverse directions, and alignment (BLAST) of the sequenced fragments against DNA, RNA, and protein databases was performed to verify the accuracy of the sequenced fragments. Then, phylogenetic relationships and the frequency of nucleotide mutations were examined and analyzed in these genes. MEGA5 and BLAST software were used to examine phylogenetic relationships (the maximum likelihood method) and analyze nucleotide sequences (including frequency and substitution). Clustal Omega software was used to examine the alignment of nucleotide and protein sequences. Amino acid analysis (the percentage and weight of amino acids and inferred proteins) was performed with Bio Edit and MEGA5 software, and the Neutrality test was performed with MEGA5 software. Results: For the first time in this research, a portion of the coding sequence of the C4H, C3'H, and HCT genes was identified in Sonchus arvensis and registered in GenBank with accession numbers ON014597.1, ON014595.1, and ON014596.1, respectively. The results of the analysis of nucleotide sequences showed that nucleotide frequency for C4H, C3'H, and HCT genes were the highest for adenine (28.1), guanine (28.4), and thymine (1.1), respectively, and the lowest nucleotide frequency belonged to thymine (13.2), thymine (20.1), and cytosine (19.7), respectively. Moreover, the neutrality test results showed the directional selection of these genes during evolution. The transition substitution mutation was more frequent than the transversion substitution mutation. The results of phylogenetic analysis based on C4H, HCT, and C3'H gene sequences showed a close phylogenetic relationship or a low genetic distance between S. arvensis and lettuce (L. sativa). The results of the sequence blast at both the nucleotide and protein levels showed a high similarity to evolutionarily close plants, such as L. sativa. Conclusion: The results of this research positively evaluated the process of natural selection during evolution for the studied C4H, C3'H, and HCT genes, which indicates the effects of genetic drift or the balancing effects of population evolution throughout history, and a low difference between the frequencies of the polymorphisms. The BLAST results of sequenced C4H, HCT, and C3'H gene fragments in S. arvensis at the nucleotide and protein levels showed the highest percentage of similarity (lowest genetic distance) to plants such as L. sativa and Cichorium intybus, which confirmed the accuracy of the sequence results. Additionally, phylogenetic analysis based on the sequencing of C4H, C3'H, and HCT genes showed a close phylogenetic relationship between S. arvensis and L. sativa.  </div> تجزیه فیلوژنی, جهش‎ های نوکلئوتیدی, ژن سینامات4-هیدروکسیلاز اسید, شیرتیغک وحشی, کلروژنیک اسید Blast, Nucleotide mutations, Phenolic acid, Phylogeny analysis, Sequencing, S. arvensis 82 93 http://jcb.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-378-8&slc_lang=fa&sid=1 Roghaieh Azizyan رقیه عزیزیان r.azizyan@yahoo.com 100319475328460025968 100319475328460025968 No Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran فارغ التحصیل دکتری، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران Babak Abdollahi Mandoulakani بابک عبدالهی مندولکانی b.abdollahi@urmia.ac.ir 100319475328460025969 100319475328460025969 Yes Department of Agricultural Biotechnology, Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران