Journal of Crop Breeding

fa بررسی ازنو اطلس بیانی بیوسنتز اسید چرب و توکوفرول در گیاه دانه روغنی گلرنگ، رقم زراعی گلدشت A de novo Analysis for the Expression Atlas of Fatty Acid and Tocopherol Biosynthesis in Safflower Oilseed Plants, Cultivar Goldasht بيوتكنولوژي گياهي بيوتكنولوژي گياهي پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: گیاه دانه روغنی گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) دارای ویژگی‌های زراعی و عملکردی مطلوبی است که آن را به گزینه‌ای مناسب برای اهداف کاربردی مختلف و دستیابی به توسعه پایدار در صنعت غذا، انرژی و دارو تبدیل می‌کند. این گیاه کاربردهای مختلفی از جمله استفاده‌های پزشکی، صنعتی و تغذیه‌ای دارد. کیفیت بالای روغن (بیش از 90 درصد اسیدهای چرب غیراشباع اولئیک و لینولئیک)، تحمل بالا در برابر تنش‌های غیرزیستی (سرما، شوری و خشکی) و دامنه وسیع کشت، همیشه مورد توجه بوده&lrm;اند. آگاهی از اطلس بیانی این گیاه در طول دوره &rlm;ی رشد و نمو برای بهینه‌سازی و تکامل ویژگی‌های زراعی، بهبود عملکرد، کیفیت محصول و اطمینان از عوامل تغذیه‌ای و سلامتی که امکان تولید یک محصول کاربردی را فراهم می‌کند، بسیار مهم است. کشت و کار این گیاه صنعتی به واسطه ی کیفیت مطلوب روغن استحصال شده از بذور آن اخیرا در کشور&rlm;های با اکوسیستم گرم و خشک،&rlm; مورد توجه قرار گرفته است. عوامل محدودکننده در تسریع برنامه‌های اصلاحی گلرنگ، کمبود دانش دقیق در مورد ساختار ژنوم و عملکرد ژن‌ها به&lrm;منظور بهبود کیفیت و کمیت این گیاه است. بیشتر مطالعات NGS گلرنگ برای بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای مولکولی در گلرنگ انجام شده&lrm;اند. در این مطالعه، عوامل مولکولی دخیل در بیوسنتز اسیدهای چرب و توکوفرول بذرهای گلرنگ بر پایه داده &rlm;های RNA-seq مورد بررسی قرار گرفته &lrm;اند. مواد و روش‌ها: در این تحقیق، رقم گلدشت از میان ارقام بومی و تجاری گلرنگ موجود در کشور انتخاب شد. این رقم دارای ویژگی‌های برجسته‌ای از جمله تحمل بالا به شوری و خشکی، گل‌های قرمز، عدم وجود خار، ارتفاع متوسط و قوزه &rlm;های بزرگ است. بذور در سال زراعی 97-98 و در مزرعه تحقیقاتی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری کشت شدند. نمونه‌گیری با نظارت روزانه در خصوص رشد گیاه پس از آغاز رشد زایشی از بافت بذر انجام شد. نمونه‌ها از مراحل نمو بذر شامل تشکیل بذر (14 روز پس از شروع گلدهی)، پر شدن بذر (28 روز پس از شروع گلدهی) و رسیدن فیزیولوژیک (35 روز پس از شروع گلدهی) برای بررسی ازنو اطلس ترانسکریپتوم نمو بذر گلرنگ جمع‌آوری شدند. هر نمونه شامل پنج زیرتکرار و دو تکرار بود. RNA کل از نمونه‌ها با استفاده از روش تغییریافته ترایزول استخراج شد. در این مطالعه از پلتفرم  BGISEQ-500برای توالی &rlm;&rlm;یابی استفاده شد و خوانش‌هایی با طول 100 جفت باز برای هر کتابخانه به &lrm;صورت pair-end تولید کرد. برای ارزیابی کیفیت و پاکسازی خوانش‌های خام هر کتابخانه، به &lrm;ترتیب از نرم‌افزارهای FastQC و Trimmomatic استفاده شد. برای سرهم‌بندی خوانش‌های فیلترشده همه نمونه‌ها از نرم&lrm; افزار Trinity استفاده شد. ترانسکریپت‌های با بیان متمایز (DETs) و خوشه‌بندی آنها با استفاده از بسته DESeq2 در R به&lrm;‌دست آمد. حاشیه &lrm;نویسی عملکردی با استفاده از Trinotate و غنی‌سازی ژن با استفاده از بسته goseq در R و شناسایی مسیرهای بیوشیمیایی با استفاده از پایگاه داده KEGG انجام شدند. یافته‌ها: در نتیجه توالی &rlm;یابی به&lrm; طور متوسط از هر کتابخانه بالغ بر 71 میلیون خوانش به دست آمد. در نتیجه سرهم &rlm;بندی از&rlm;نو و ایجاد ترانسکریپتوم مرجع، نرخ هم ردیفی داده&rlm; های خام بر&rlm; علیه فایل نهایی سرهم &rlm;بندی شده 29/97 درصد بود. پس از غربال&rlm;گری داده &rlm;ها، تعداد 86،585 ترانسکریپت در قالب 68،809 ژن دسته‌بندی شدند. در مجموع، تعداد 16،755 ترانسکریپت با بیان افتراقی شناسایی گردید. بیشترین میزان ترانسکریپت &rlm;های شناسایی شده با بیان افتراقی در مقایسات دوتایی و در طول مراحل نمو بذرمربوط به فاز گذر از مرحله &rlm;ی پر شدن بذر (seed filling) به مرحله&rlm; ی بلوغ بذر (seed maturation) با 10،198 ترانسکریپت بود. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل داده&rlm; های اطلس ترانسکریپتوم بذر، سه الگوی اصلی بیان ژن مشهود بود. بیشتر ‌ژن‌ها در 14 روز پس از گل‌دهی (DAF) به اوج رسیدند که هم‌زمان با افزایش سریع محتوای روغن در طول توسعه بذر بود. ‌ژن‌هایی که در 14 و 28 روز پس از گل‌دهی بیان بالایی داشتند، با تشکیل متابولیت‌ها و مراحل اولیه سنتز روغن، از جمله تشکیل پیرووات و استیل-CoA، مرتبط بودند. همچنین، ژن‌های مرتبط با ذخیره‌سازی پروتئین در 35 روز پس از گل‌دهی به اوج خود رسیدند. ‌ژن‌ها&rlm; با استفاده از پنج پایگاه داده عمومی (NR، COG، Swiss-Prot، KEGG و GO) شناسایی شدند. در پایگاه داده KEGG، همه ‌ژن‌های شناسایی شده در 398 مسیر زیستی و هشت دسته عملکردی طبقه‌بندی شدند که بیوسنتز اسید چرب و توکوفرول با سنتز متابولیت‌های لیپید و یوبی‌کینون در طول رشد و توسعه بذر گلرنگ مرتبط بودند. نتیجه‌گیری: پروفایل بیان ژن&rlm; های درگیر در بیوسنتز اسید&rlm;چرب غیر اشباع، نشان از تمرکز بیان آن&rlm;ها در مرحله اول نمو بذر داشت. همچنین، این میزان بیان در مرحله بلوغ در کمترین میزان خود قرار داشت. بررسی پروفایل بیانی ژن&rlm; های درگیر در مسیر متابولیکی بیوسنتز توکوفرول نشان از تمرکز بروز این ژن&rlm; ها در مراحل میانی و پایانی نمو بذر داشت که نشان‌دهنده رابطه زمانی واضح بین تجمع روغن و تغییرات فیزیولوژیکی در دانه‌های گلرنگ است. این مطالعه بیان می &lrm;کند که اوج بیان ژن‌های مرتبط با بیوسنتز اسیدهای چرب زودتر از توسعه دانه‌ها رخ می‌دهد. همچنین، تجمع روغن قبل از تجمع پروتئین‌ها در دانه‌های گلرنگ آغاز می‌شود. شناسایی عوامل مولکولی دخیل در بهبود عملکرد گیاه و تبیین ارتباط بین آنها با یکدیگر و همچنین محیط، می &lrm;تواند ابزار ارزشمندی برای مدیریت بهتر زراعی و فعالیت &rlm;های اصلاحی در اختیار اصلاح&lrm; گران قرار دهد.  </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: The safflower oilseed plant (Carthamus tinctorius L.) has favorable agronomic and yield characteristics that make it a suitable crop for various practical purposes and achieving sustainable development in the food, energy, and pharmaceutical industries. This plant has various medical, industrial, and nutritional applications. The high quality of the oil (more than 90% unsaturated fatty acids of oleic and linoleic acids), high tolerance to abiotic stresses (cold, salinity, and drought), and the wide range of cultivation have always been of interest. Knowledge of the expression atlas of this plant during its growth and development helps to modify agricultural characteristics, including improving yield, quality, nutritional, and health factors. Due to the good quality of the oil extracted from its seeds, the cultivation of this industrial plant has recently received attention in countries with hot and dry ecosystems. The lack of detailed knowledge about the genome structure and the function of genes is one of the limiting factors to accelerate safflower breeding programs to improve the quality and quantity of this plant. Most safflower NGS studies have been conducted to investigate genetic diversity and identify molecular markers. In this study, the molecular factors involved in the biosynthesis of fatty acids and tocopherol of safflower seeds are considered based on RNA-seq data. Methods: In this research, the Goldasht variety was selected among the local and commercial safflower varieties available in Iran. This variety has outstanding features, such as high tolerance to salinity and drought, red flowers, spineless, medium height, and large capitula. The seeds were planted in the research farm of the National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology in the 2018-2019 cultivation year. The plants were sampled with the daily monitoring of plant growth after the start of reproductive growth. Samples were collected from seed development stages, including seed formation (14 days after flowering), seed filling (28 days after flowering), and physiological ripening (35 days after flowering), to examine the transcriptome of safflower seed development. Each sample consisted of five sub-replicates and two replicates. Total RNA was extracted from the samples using a modified Trizol method. In this study, the BGISEQ-500 platform was used for sequencing and produced 100 bp pair-end reads for each library. FastQC and Trimmomatic software were used to evaluate the quality and clean up the raw reads of each library, respectively. Trinity software was used to assemble the filtered reads of all samples. Differentially Expressed Transcripts (DETs) and their clustering were obtained using the DESeq2 package in R. Functional annotation was performed using Trinotate, gene enrichment was performed using the goseq package in R, and the biochemical pathway was identified using the KEGG database. Results: An average of 71 million reads was obtained from each library. As a result of reassembling and creating a reference transcriptome, the alignment rate of raw data against the final assembled file was 97.29%. After screening the data, 86,585 transcripts were categorized into 68,809 genes. A total of 16,755 DETs were identified in this analysis. The highest number of transcripts identified with differential expression in pairwise comparisons and during the seed development stages belonged to the transition phase from seed filling to seed maturation, with 10,198 transcripts. Three main patterns of gene expression were evident based on the results of seed transcriptome atlas data analysis. Most genes at 14 days after flowering (DAF) coincided with a rapid increase in oil content during seed development. Genes that were highly expressed at 14 and 28 DAF were related to the formation of metabolites and early stages of oil biosynthesis, including the formation of pyruvate and acetyl-CoA. Moreover, genes related to protein storage peaked at 35 DAF. Genes were identified using five public databases (NR, COG, Swiss-Prot, KEGG, and GO). In the KEGG database, all identified genes were classified into 398 biological pathways and eight functional categories, which were related to fatty acid and tocopherol biosynthesis, with the synthesis of lipid metabolites and ubiquinone during safflower seed growth and development. Conclusion: The expression profile of the genes involved in the biosynthesis of unsaturated fatty acids showed a higher frequency of their expression in the first stage of seed development. Furthermore, this level of expression was at its lowest level during seed maturation. Studying the expression profile of the genes involved in the metabolic pathway of tocopherol biosynthesis showed a higher frequency of occurrence of these genes in the middle and final stages of seed development, which indicates a clear temporal relationship between oil accumulation and physiological changes in safflower seeds. This study shows that the increased expression of genes related to fatty acid biosynthesis occurs earlier than seed development. Besides, oil accumulation begins before the accumulation of proteins in safflower seeds. Identifying the molecular factors involved in improving plant yield and the identification of the interaction between them as well as with the environment can be a valuable tool for better crop management and breeding activities.  </div> اسید چرب غیر اشباع, بیان ژن, توکوفرول, گلرنگ, De novo RNA-seq De novo RNA-seq, Gene expression, Safflower, Tocopherol, Unsaturated fatty acids 60 73 http://jcb.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1276-1&slc_lang=fa&sid=1 Farshid Sharifian فرشید شریفیان mealavi@nigeb.ac.ir 100319475328460026340 100319475328460026340 No Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran گروه بیوتکنولوژی مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران Hassan Jamshidi حسن جمشیدی farshidsharifian69@gmail.com 100319475328460026341 100319475328460026341 No Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran گروه بیوتکنولوژی مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران Seyed Mehdi Alavi سید مهدی علوی jamshidiha2002@gmail.com 100319475328460026342 100319475328460026342 Yes Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran گروه بیوتکنولوژی مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران Naser Farrokhi ناصر فرخی n_farrokhi@sbu.ac.ir 100319475328460026343 100319475328460026343 No Department of Cell & Molecular Biology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran گروه بیولوژی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران